先说结果：我没做出来
研二那年的四月到七月，我大概有九十多天泡在生物楼负一层的冷室里。老板当时跟我说的话是「这个蛋白师姐已经做出来了，你把 protocol 抄一遍，两周能出数据」。后来我数了一下，那本实验记录上我用掉的页码是 47 页，最后一页写着「7月18日，放弃，转真核」。
我第一次跑 SDS-PAGE 的时候，把 12% 的分离胶配错了，APS 忘了加，等了四十分钟还是水。那天我在走廊上给我妈打电话，说我想退学。她问我是不是实验做不出来，我说不是，是胶凝不了。现在想想挺可笑的，但那会儿真的觉得天塌了。
配好胶之后，结果一点也不意外，也一点都不客气。
全在沉淀里
我的条件是：pET-28a 载体，BL21(DE3)，LB 培养基加 Kan 50 μg/mL，37℃ 220 rpm 摇到 OD600 到 0.6 左右，加 IPTG 到终浓度 0.5 mM。我试了两批，一批 37℃ 诱导 4 小时，一批降到 16℃ 诱导 20 小时。
上清和沉淀分开跑胶。37℃ 那批，沉淀里有一条非常粗的带，大概在 28 kDa，上清几乎什么都没有。16℃ 好一点，上清里能看到一条很淡的带，但沉淀里还是那条粗带。
我当时的第一反应是「降温度、减 IPTG 就能解决」。文献上也这么写。所以我从 0.5 mM 降到 0.1 mM，从 16℃ 降到 12℃ 诱导 24 小时。上清里那条带确实粗了一点，大概从「看不见」变成了「看得见」，但距离能纯化出毫克级还差着十万八千里。
这就很坑。因为你在跑胶的时候看到一点点带，会误以为快成功了，然后你又愿意再赌一个月。
复性和我冻僵的手指
包涵体复性，我按最经典的流程走的：菌体超声破碎，功率 200 W，工作 3 秒间歇 5 秒，全程冰浴，大概 30 分钟。12000 rpm、4℃ 离心 20 分钟收沉淀，用含 2 M 尿素的缓冲液洗两遍，再用 8 M 尿素溶解。
然后上镍柱。缓冲液是 20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，洗脱用 250 mM 咪唑。这一步其实挺顺的，8 M 尿素里蛋白老老实实挂在柱子上，洗脱峰也很漂亮。
问题出在透析复性。我从 6 M 尿素开始往下降，4 M、2 M、1 M、0.5 M，每步至少 6 小时，4℃ 冷室里慢慢搅。第一次降到 1 M 的时候，溶液肉眼可见变浑了。离心一看，全沉了。第二次我加了 0.5 M L-精氨酸，加了 1 mM GSH 和 0.2 mM GSSG，好一点，能留在 0.5 M 尿素那步不沉，但最后拿到的东西活性是零，或者说和阴性对照没区别。
我到现在还记得冷室的味道，有点像湿掉的纸箱。手指冻得没知觉的时候拧不开离心管的盖子，要用牙咬。这事我没跟别人说过，有点丢人。
我的偏见：生物工程里的「工程」两个字，我觉得是吹的
这段我要说点不好听的。
我做这个课题之前一直以为生物工程是个很「工程」的学科，就是你有模块，有参数，有输入输出，你调一调就能出来。真的进实验室之后我发现，至少在蛋白表达这个层面上，它更像是「你有一个黑盒子，你往里扔条件，扔到某一次它高兴了，给你出东西」。
你说的那些理性设计——密码子优化、标签位置、宿主菌株、诱导条件——每一条都有道理，但每一条对结果的贡献都很难量化。你改五个参数，出来了，你根本不知道是哪一个起了作用。你要是改一个，它没出来，你也不知道是不是因为另外四个没改。
而且更别提，你的对照组和实验组之间的差异，往往比批次之间的差异还小。我同一个条件做过三次，一次上清有带，一次没有，一次跑出来胶上全是笑脸。所以我现在看到那种「AI 设计蛋白、理性改造、一次性成功」的宣传，第一反应就是先翻到文章最后看看他们有没有给批次重复和阴性对照。很多不给。
后来我干了什么
最后我换了体系，用真核表达，成本高很多，一个摇瓶的培养基要小两百块，做得也慢，但至少上清里能看到东西。
现在回头看，三个月不是白花的，但也没什么值得美化的。如果让我给现在的自己一句话，我会说：包涵体这个事，先花两周确认它是不是必须复性，别一上来就死磕。有些蛋白在大肠杆菌里就是出不来，这不是你的错，也不是你不够努力。
还有一个小建议，如果你也在做复性，先用小体积试，100 mL 菌的量就够，别一上来摇 1 L。我浪费掉的 8 M 尿素和咪唑，现在想想都心疼。
至于那个蛋白，我后来再也没碰过。